X
تبلیغات
سفیدپوشان بی ادعا/علوم آزمایشگاهی مشهد/ - آزمایشگاه بیو شیمی
خون شناسی.ویروس شناسی.سلولی وملکولی.بیوشیمی ومطالب مرتبط با علوم آزمایشگاه

آزمایشگاه بیو شیمی

شما ميتونيد كل اين بخش رو به صورت پاورپوينت شده دانلود كنيد.

--دانلود فايل پاورپوينت آزمایشگاه بیو شیمی(كليك كنيد)

  • کاربرد اسپکترو فتو متری در بیو شیمی
  • 1 – اسپكتروفتومتر
  • بوسيله اسپكتروفتومتر شدت رنگ محلولها را با دقت اندازه گيري مي كنند.
  • دستگاههائي كه براي رنگ سنجي به كار برده مي شوند الكتروفتومترو يا اسپكتروفتومتر ناميده مي شوند.                                                                      
  •  شماي ساده زير قسمتهاي مختلف يك الكتروفتومتر را نشان مي دهد.

بطور كلي هر اسپكتروفتومتر:

  •  يك منبع نوراني،
  • يك وسيله ايجاد نور تكرنگ با طول موج مشخص
  •  يك سلول يا لوله مخصوص براي جادادن محلول رنگي
  • ، يك سلول فتوالكتريك و يك گالوانومتر دارد.
  • اندازه گيري غلظت يك محلول

                                به دو روش مي توان غلظت يك محلول را اندازه گيري كرد:

الف) از راه اندازه گيري نوري كه از محلول رنگي خارج مي شود و

به آن ،Transmitance   ،یا عبور می گویند؛

ب) اندازه گيري مقدار نوري كه جذب محلول رنگي مي شود و به آن دانسيته اپتيك   (OPTICAL DENSITY) O.D يا آبسوربنس مي گويند.

  










الف) دانسيته اپتيك يا آبسوربنس

نوري كه از يك محلول رنگي عبور مي كند مقداري از آن جذب محلول رنگي مي شود .

اگر Io شدت نور اوليه و I شدت نور خارج شده از محلول باشد بنابراين  I a شدت نوري است كه جذب محلول رنگي گرديده است.

Ia                                     = I  - Io

Log Io   - log I =OD = Absorbanc              

logI/I0=OD                                

 (1)         log I0/I=OD

  •  
  • جذب از دو قانون پيروي مي كند:
  • مطابق قانون بيرولامبرت (BEER & LAMBERT) هنگاميكه نور يك رنگ از محلول رنگي عبور ميكند مقدار نوري كه به وسيله محلول جذب مي شود ويا مقدار نوري كه از محلول خارج مي شود؛
  •  به غلظت ماده رنگي موجود در محلول
  • به ضخامت لوله ايكه نور از آن عبور كرده بستگي دارد گردد.یعنی: 
  • OD=KCL                              = جذ ب                           

                                               

  • قانون بیر لامبرت

logIo/I= KCL                                                         

كه در آن K  ضريب جذب ماده مورد آزمايش، C  غلظت جسم مورد آزمايش و L قطر لوله مي باشد و چون معمولاً قطر لوله را مساوي يك سانتي متر اختيار ميكنند بنابراين خواهيم داشت:    OD= log I0/I=KC    

K يا ضريب جذب ماده براي مواد مختلف فرق مي كند و به آساني قابل اندازه گيري است.

                               

  • میزان عبور یا ترا نسمیتا نس

ب) ترانسميتانس ) عبور) :

  مقدار نوري است كه از محلول رنگي مورد آزمايش خارج مي شود،

 اگر شدت نور اولي  I0  و نور خارج شده I باشد:

I0-I=Ia                                                

      

  I/I0=T         Log I0/I=Log1/T      OD=Log1/T

              

  • مثال در مورد جذب وعبور

اگر نور وارد شده در محلول 100 و نور خارج شده از آن 10 درصد نور اوليه باشد خواهيم داشت:

OD= log 100 –log 10                 

OD= 2-1                             

OD =1                              

                                                 

  • نحوه درجه بندی دستگاه اسپکتروفوتومتر
  • روي صفحه مدرج دستگاه در قسمت بالا درصد نور عبور كرده يا ترانسمیتانس
  • در قسمت پائين درست در مقابل درجات ترانسمیتانس OD،یا ابز ربنس قرار مي هند.
  • ، درجات میزان عبور همه با هم مساوي است.
  •  درجات O D به علت لگاريتمي بودن نامساوي هستند.
  • روش كار و اندازه گيري جذب يك محلول

آزمايش 1 – بهترين طول موج براي اندازه گيري غلظت يك محلول رنگي چيست؟

مي دانيد كه از تجزيه نور سفيد نورهاي مختلف رنگي حاصل مي شود كه در قسمت مرئي داراي طول موجهاي زير مي باشد.

     بنفش 420-430، آبي470-490،   سبز520-550 ، زرد580

  • انتخاب طول موج مناسب جهت اندازه گیری جذب
  • محلول مورد آزمايش رادرمعرض تابش نورهايي با طول موجهاي مختلف قرارداده OD هاي قرائت شده  را يادداشت مي كنيم.
  • نمودار جذب برحسب طول موج را رسم می کنیم.
  • طول موج منا سب ،طول موجی است که ماکز یمم جذب را دارد.
  • روش انجام آزمایش
  • آزمايش 2 – جهت رسم منحني دانسيته اپتيك بر حسب غلظت هاي مختلف:
  • 6 لوله آزمايش انتخاب كرده آن ها را از 1 تا 6 شماره گذاری کنید
  • به ترتیب در آنها 0 ؛1، 2، 4، 6 و 8 میلی لیتر محلول بروموفنل( mg/L10 )  بریزید.
  • سپس به ترتیب 10 ، 9 ،8 ، 6 ،4 و2 میلی لیتر آب مقطر بریزید.

  

  • صفر دستگاه را با لوله شماره 1 ميزان کنید.
  • مقدار دانسيته اپتيك لوله هاي بعدي را در 580 ميلي ميكرون اندازه بگيريد
  • منحني تغييرات دانسيته اپتيك بر حسب غلظت محلول رسم نمائيد.
  • در صورتيكه منحني از قانون بير متابعت كند به صورت يك خط مستقيم خواهد بود.
  • دو نكته: عملي
  • 1 – در قرائت OD نتايج، زماني قابل اطمينان است که:
  •                               0.7 < OD <0.1
  • بنابر اين غلظت مجهول اگر زياد باشد بايد آنرا با حلال مربوطه طوري رقيق نمود كه OD آن در حدود بيان شده قرار گيرد.
  • در اين صورت ضريب رقت را باید در محاسبه منظور نمود.
  • 2 – اگر قرائت OD چندين مجهول پشت سر هم بخواهد  انجام گيرد در فواصل قرائت بايد دستگاه را با شاهد (BLANK) روي صفر OD تنظيم نمود.

                      روشهاي جدا كردن مواد از يكديگر

  • دياليز ، با استفاده از كيسه هاي سلوفان.
  • ژل فيلتراسيون “GEL FILTRATION”..
  • كروماتوگرافي هاي مختلف (لايه نازك – جذبي – تعويض يوني – كاغذي)
  • الكتروفورز
  • آزمايش قندها يا گلوسيدها
  • قندها يا ساكاريدها را به سه دسته تقسيم مي كنند:
  • دسته اول منوساكاريدها
  • پلي الكلهاي 3 تا 7 كربني هستند كه يكي از عاملهاي الكلي به عامل كربنيل تبديل شده است و به ترتيب آنها را تريوز تتروز- پنتوز- هگزوز- هپتوز مي نامند.
  • منوساكاريدها ممكن است داراي عامل آلدئيدي يا ستني باشند كه در حالت اول آلدوز و در حالت دوم ستوز ناميده مي شوند.
  • مهمترين پنتوزها: آرابينوز گزيلوز ريبوز و
  • مهمترين هگزوزها: گلوكز-مانوز-گلاكتوز-فروكتوز مي باشند.
  • دسته دوم اليگوساكاريدها
  • از اليگو ساكاريدها، دي ساكاريدها داراي اهميت بيشتري هستند.
  •  بعضي از دي ساكاريدها داراي خاصيت احياكنندگي مي باشند مانند: مالتوز و لاكتوز.
  •  برخي ديگر داراي خاصيت احياء كنندگي نيستند. مانند ساكارز يا سوكروز.
  • دسته سوم پلي ساكاريدها
  • مهمترين پلي ساكاريدها شامل نشاسته، سلولز و گليكوژن مي باشد.
  • واكنش رنگي قندها
  • مهمترين واكنش هاي رنگي قندها به قرار زيرند:
  • 1 – واكنش موليش (Molisch) : a- نفتل + اسيد سولفوريك غليظ ؛
  • اين واكنش براي تمام ساكاريدها مثبت است.
  • 2 – واكنش بارفود (Barfoed) : استات مس در اسيد استيك 1%؛
  • اين واكنش مخصوص منوساكاريدهاست.
  • 3 – واكنش بيال    (Bial)اورسينول در اسيد كلريدريك + FeCl3  ؛
  •  به پنتوزها مانند گزيلوز جواب مثبت مي دهد.
  • –4 واكنش سليوانف (Selivanoff) : رزورسينول در HCl  ؛
  •     اين واكنش مخصوص ستوهگزوزها مانند فروكتوز مي باشد آلدوهگزوزها بكندي       واكنش مي كنند.
  • 5 – واكنش بنديكت (Benedict) : محلول قليائي سيترات مس ؛
  •       اين واكنش به تمام قندهاي احياء كننده جواب مثبت ميدهد مانند منوساكاريدها  (گلوكز –فروكتوز) و دي ساكاريدهاي احيا كننده نظير لاكتوز و مالتوز
  •         محلول فهلينگ (Fehling) نيز نظير بنديكت واكنش می دهد.

6-- واكنش يد (Iodine test) :

محلول يد با نشاسته و گليگوژن ايجاد رنگ مي نمايد.

 در حاليكه با سلولز و دكسترين و اينولين رنگي نمي دهد.

7

  • –7                      واكنش تشكيل اوزازون (Osazone formation
                               منو و دي ساكاريدهاي احياء كننده با محلول فنيل هيدرازين    قليایی توليد بلوريهاي مشخص مي نمايند.
             
     اوزازون گلوكز  فروكتوز و مانوز شبيه يكديگرند .
                    بعضي از اوزازون ها مانند لاكتوزازون در گرما محلولند.
  • واكنشهاي اختصاصي قندها

1 واكنش موليش

اين واكنش به تمام قندها جواب مثبت مي دهد.

 قندها در مجارت اسيدهاي غليظ آب از دست داده و تبديل به فورفورال يا مشتقات آن مي شوند؛

اين جسم با محلول الكلي آلفا- نفتل ماده رنگي ايجاد مي كند.

خلاصه واكنش ها به قرار زير است:

 

  • 2 واكنش بارفود (Barfoed)
  • اين واكنش وجود منوساكاريدها را مشخص مي نمايد.
  •  به 4 ميلي ليتر معرف بارفود يك ميلي ليتر از قند مورد آزمايش اضافه مي كنيم.
  • لوله آزمايش را به مدت 3 تا 5 دقيقه در آب جوش قرار مي دهيم.
  •  در منوساكاريدها رسوب قرمز اكسيد كوئيورو در ته لوله تشكيل مي گردد
  • .
  • اين آزمايش را با يك پنتوز (گزيلور)، گلوكز يا فروكتوز، لاكتوز انجام دهيد.
  • 3- واكنش مور (Moor)
  • اين واكنش به قندهاي احياء كننده جواب مثبت مي دهد.
  • ، به 5 ميلي ليتر محلول قند 1 ميلي ليتر سود 10% افزوده و آنرا در آب جوش قرار مي دهيم.
  •  بعد از 5 دقيقه ايجاد رنگ قهوه اي و بوي مشخص دليل بر مثبت بودن واكنش است.
  • محلول گلوكز، مالتوز، ساكارز، و نشاسته را آزمايش کنید.

4 واكنش بنديكت (Benedict)

به قندهاي احياء كننده جواب مثبت مي دهد.

 به 5 ميلي ليتر معرف بنديكت كيفي 8 تا 10 قطره از محلول مورد آزمايش اضافه کنید.

براي 5 دقيقه در آب جوش بگذا رید .

پس از سرد شدن در صورتي كه رسوب سبز، زرد يا قرمز ايجاد شود دليل بر وجود قند احياء كننده است.

  اين آزمايش را بر روي گلوكز، فروكتوز، گزيلوز، ساكارز و مالتوز انجام دهيد.

  •    -5واكنش فهلينگ (Fehling)
  •      فهلينگ A محتوي سولفات مس است.   
  •        فهلينگ B محتوي تارترات سديم و پتاسيم و كمي هيدروكسيد سديم است.
  • 1ميلي ليتر فهلينگ A و 1 ميلي ليتر فهلينگ B را مخلوط می کنیم.
  • 2 ميلي ليتر از محلول مورد آزمايش روي آن ريخته و مي جوشانيم.
  • اگر محلول مورد آزمايش قند احيا كننده باشد رسوبي توليد مي شود؛
  •  كه رنگ آن از زرد به قرمز متغيير است
  • –6 واكنش سليوانوف (Selivanoff)

•          اين واكنش به ستوزهائي كه داراي عامل ستني هستند جواب مثبت مي دهد.

•          به 5 ميلي ليتر معرف سليوانف 5 قطره از محلول قند مورد آزمايش افزوده آنرا در              حمام ماري جوشان براي 90 ثانيه و يا روي شعله مستقيم براي 45 ثانيه حرارت مي دهيم .

      رنگ يا رسوب قرمز دليل وجود ستوز است.

•          اگررسوب را در الكل اتيليك حل كنيم الكل به رنگ قرمز در مي آيد.

  • واكنش سليوانف بسيار حساس است.
  • اگر قندهاي ديگري با غلظت زياد يعني بيش از 2% بدان اضافه شود همين رنگ را توليد مي نمايد.
  • ساكارز اگر كمي بيشتر از زمان ذكر شده حرارت داده شود چون هيدروليز مي شود لذا به واكنش سليوانف جواب مثبت مي دهد.

  • .
  • فرمول احتمالي تركيب قرمز رنگ در آزمايش سليوانف :
  • –7 واكنش بيال (Bial)
  • براي تشخيص پنتوزها از واكنش بيال و تائوبر استفاده مي شود.
  • بر روي 5 ميلي ليتر معرف بيال 2 ميلي ليتر از محلول مورد آزمايش اضافه مي كنيم
  • .به ملايمت حرارت مي دهيم تا بجوشد سپس آنرا سرد مي كنيم.
  •   رنگ آبي تا سبز وجود پنتوز را مشخص مي كند.
  • -8واكنش تشكيل اوزازن

       اين واكنش مخصوص تمام منوو دي ساكاريدهاي احياء كننده است.

  • درهر يك از چهار لوله 2 ميلي ليتر از معرف فنيل هيدرازين.
  • و سپس بترتيب 2 ميلي ليتر از قندهاي آرابينوز، گلوكز، لاكتوز و مالتوز.
  • لوله ها را براي مدت 15 تا 30 دقيقه در آب جوش قرار مي دهيم.
  •  سپس در حرارت آزمايشگاه خنك می کنیم .
  •  با يك پيپت يك قطره از رسوب را روي لام گذارده و با لامل آنرا می پوشانیم.
  •  در زير ميكروسكوپ بلورهاي آنها را مشاهده مي‌كنيم.

زمان تشكيل اوزازن براي قندهاي مختلف به شرح زير است:

فروكتوز              2 دقيقه

گلوكز                 15-19 دقيقه

لاكتوز                پس از سرد شدن كاملاً سرد مي كند.

مالتوز                 پس از سرد شدن كاملاً رسوب مي كند.

ساكارز                در مدت آزمايش رسوبي ايجاد نمي كند

 

بلورهاي اوزازان از بالا و به ترتيب عبارتند از:

گلوكزازن                        گالاكتوزان

آرابينوزازن                      لاكتوزازن

مالتوزازن                        گزيلوزازن

  • –9 هيدروليز ساكارز
  • در 3 ميلي ليتر از محلول ساكارز يك تكه كاغذ قرمز كنگو ابیاندازید.
  •  قطره قطره اسيد كلريدريك 1% بیافزائید تا كاغذ به رنگ آبي درآيد (PH در حدود 3-2).
  •  مخلوط را براي مدت 5 دقيقه بجوشانید.
  • روي محلول هيدروليز شده واكنشهاي بنديكت – بارفود – سليوانف را انجام داده و نتيجه را شرح دهيد.
  • -10واكنش يد
  •   اين واكنش مخصوص پلي ساكاريدهايي نظير نشاسته و گليكوژن است.
  •  به چند ميلي ليتر از چسب نشاسته يك قطره محلول يد يدوره اضافه مي كنيم رنگ آبي بنفش توليد مي شود.
  • اگر مخلوط را بجوشانيم بيرنگ شده و پس از سرد كردن رنگ آبي دوباره ظاهر مي شود.
  • يد با گليكوژن رنگ قهوه اي توليد مينمايد.
  • تعيين مقدار گلوكز يا ساير قندهاي احياكننده به وسيله معرف بنديكت كمي

تئوری

محلول بنديكت كمي شامل مواد زیر است؛

 سولفات مس، كربنات سديم، سيترات سديم، تيوسيانات‌ پتاسيم و فروسيانور پتاسيم.

 مس دو در محيط قليايي و در مجاورت قندهاي احيا كننده به مس يك ظرفيتي (Cu2O) تبدیل  می شود.

  • براي تشخيص يك قند مجهول از جدول زير استفاده ميكنيم.
  • تعیین تیتر محلول بندیکت

در يك ارلن ماير صد ميلي ليتري 20 ميلي ليتر بنديكت كمي مي ريزيم.

3 تا 5 گرم كربنات سديم و كمي خرده شيشه بر روي آن مي افزاييم،.

 آن را در روي شعله به ملايمت مي جوشانيم.

از بورت گلوكز 2 گرم در ليتر قطره قطره در حال جوش اضافه مي كنيم تا رنگ آبي محلول از بين برود.

تيتر محلول بنديكت از رابطه زير بدست مي آيد:

t.N                                                  

T=                                                             

N                                                                                                                            

       تيترT, ,عبارت است از:

مقدارگرم قند احيا كننده ای كه بتواند يك ليتر محلول بنديكت را احيا نمايد.

       دررابطه ؛      T= t.n/N

t       غلظت گلوكز (2 گرم در هزار)

         n ميلي ليتر گلوكز مصف شد

N      ميلي ليتر بنديكت (ml 20) است.

       تعیین مقدار قند احیا کننده

     قنداحياء كننده مورد آزمايش را در بورت ريخته.

    عمليات را عيناً مانند آزمايش قبل (تيتراسيون بنديكت) انجام مي دهيم .

    غلظت قند را بر حسب گرم در ليتر از تساوي زير بدت مي آوريم:

T.N                          

X=                                  

n                            

T تيتر بنديكت و N حجم بنديكت مورد مصرف (ml 20) و n ليتر محلول قند مصرف شده است.

تبصره : مي توان اندازه گيري غلظت گلوكز را با محلول فهلينگ در مجاورت فروسيانور پتاسيم نيز انجام داد ولي محلول بنديكت به علت خواص زير بر محلول فهلينگ رجحان دارد:

1 – خاصيت قليايي محلول بنديكت از محلول فهلينگ كمتر است لذا باعث پليمريزاسيون شدن قندها نمي شود.

2 – محلولهاي احياء كننده ضعيف مانند اسيد اوريك بر محلول بر محلول بنديكت اثر نداشته در صورتيكه محلول فهلينگ را احياء مي نمايد.

بنابر اين سنجش گلوكز در مجاورت احيا كننده هاي ضعيف ديگر (مانند تركيب ادرار) به كمك بنديكت به سهولت انجام پذير است.

  • گلوكزاوری

        گلوكز اوري glucosuria يعني وجود گلوكز در ادرار .

       گليكوز اوري glycosuria يعني وجود هر نوع قندي .

       جواب مثبت كاذب ممكن است در بيمارانيكه ساليسيلات، مورفين و بعضي از                  داروهاي ديگر خورده اند، ديده شود.      

   به طور معمول يك انسان سالم حداكثر يك گرم گلوكز از راه ادرار دفع مينمايد

   درگلوكزاوري مقداري گلوكز  دفع شده از اين مقدار بيشتر است.

  

   گاهي گلوكز به طور اتفاقي از ادرار دفع مي شود كه در حالات، هيجان، شوك، تحريك، ورزشكاران در ورزش هاي سنگين،

 15 درصد از بيماراني كه گلوكز در ادرار دارند، مربوط به بيماري قند نيست.

        بهترين تست براي گلوكز؛ تست گلوكز اكسيداز است.

    گلوكز در اثر آنزيم گلوكز اكسيداز تبديل به اسيد گلوكونيك gluconic و آب اكسيژنه (هيدروژن پراكسيد) می شود .

    هيدروژن پراكسيد حاصل، در مجاورت پراكسيداز ، اورتولوئيدين را اكسيد (كه آبي رنگ است) مي نمايد.

  • جستجوي گلوكز و قندهاي احيا كننده به روش بنديكت

   تهيه معرف بنديكت براي گلوكز

  • 3/17 گرم سولفات مس در 100میلی لیتر آب حل کنید.
  • 173 گرم-سیترات تری سدیک دو آبه و100گرم کربنات سدیم ایندر، در600 میلی لیترآب  بکمک حرارت حل کرده به حجم 1 لیتر برسانید.
  • دو محلول فوق را با یکدگر مخلوط وبه حجم یک لیتر برسانید.                                                          

جستجوی گلوکز در ادرار

 طريقه آزمايش:

  • 5 ميلي ليتر معرف بنديكت در لوله آزمايش ريخته و روي آن 8 تا 10 قطره ادراربریزید.
  • 1-2 دقيقه روي شعله نگاه دارید..
  •  اگر گلوكز در ادرار زياد باشد تمام محتوي لوله زرد آجري شده و رسوب می کند ، اگر مقدار آن متوسط باشد داراي رسوب و رنگ آن كاملاً آجري می شود .
  •  اگر مقدار آن كم باشد، زرد مايل به سبز مي شود
  • ليپيدها يا چربي ها
  • تعريف – ليپيدها يا چربيها مواد طبيعي حيواني يا گياهي هستند كه:
  •  در آب نامحلول اند.
  • در بعضي از حلالهاي آلي مانند:
  •  اتر – كلروفرم – بنزن و الكل گرم و غيره حل مي شوند.
  • طبقه بندي ليپيدها

  ليپديها را به دسته هاي مختلف زير طبقه بندي مي كنند.    

1- اسيدهاي چرب

2 – چربيهاي خنثي (گليسيريدها)

3 – مومها

4- فسفوليپيدها   الف- گليسروفسفوليپيده

                       ب-  اسفنگوفسفوليپيدها

5 – استروئيدها

  • آزمايشهاي ليپيدها

1 حلاليت

  •  مقدار جزئي پيه گوسفند را در هر يك از چهار لوله آزمايش بریزید.
  •  به هر كدام به ترتيب 3 ميلي ليتر از حلالهاي آب – الكل اتيليك ـ اتروكلروفرم بیلفزائید.
  • ومیزان حلالیت یا عدم حلالیت چربی را در هر کدام مشاهد ه و گزارش کنید.
  • سپس محتوي لوله چربي و الكل اتيليك را گرم نموده و نتيجه را يادداشت کنید.
  • 2 هيدروليز گليسريدها
  • 25 ميلي ليتري آب و 50 ميلي ليتر سود 10% و 4 ميلي ليتر از يك تري گليسريد (پيه ذوب شده)در یک بشر مي‌ريزيم .
  • مدت يك ساعت مخلوط را مي‌جوشانيم. باید از كم شدن حجم محلول جلوگيري نمود.
  • تری گلیسرید  هیدرولیزوصابونی می شود.

                       واکنش صابون با یون کلسیم 

 

  • به 5 ميلي ليتر محلول صابون 5 ميلي ليتر آب افزوده
  • سپس چند ميلي‌ليتر كلرور كلسيم اضافه مي‌كنيم
  •  رسوبي تشكيل مي شود اين رسوب چيست؟
  • چرا صابون در آب سخت ،خوب کف نمی کند ؟

  

  • واکنش صابون با اسید
  • 20 تا 25 ميلي ليتر از محلول صابون را در يك بشربریزید.
  • بتدريج آنقدر اسيد كلريدريك به آن بیافزاييد و به هم بزنید تا ديگر رسوبي تشكيل نشود.
  • محلول را سرد کنید، در سطح آن اسید چرب جمع می شود.
  • 3 آزمايش چربيهاي اشباع نشده

الف) واکنش چربيهاي اشباع نشده با يد.

  • چند قطره روغن زيتون را در 2 تا 3 ميلي ليتر كلروفرم حل کنید.
  • چند قطره محلول الكلي كلرور مركوريك 5 درصد و چند قطره محلول الكلي يد رقيق بدان بیافزائید.
  • رنگ قهوه اي يد از بين مي رود. ( Cl2Hg نقش كاتاليزور را دارد).چرا؟



  • ب) اكسيداسيون چربي هاي اشباع نشده به وسيله پرمنگنات پتاسيم
  • چند قطره روغن زيتون را در چند ميلي ليتر محلول كربنات سديم حل کنید.
  • سپس چند قطره محلول رقيق پرمنگنات پتاسيم بدان بیافزائید.
  • رنگ پرمنگنات از بين مي رود (كربنات سديم با ايجاد PH قليايي موجب حل شدن چربي در فاز آب مي شود).
  •              
  • ازبين رفتن رنگ پرمنگنات به علت اكسيداسيون چربيهاي اشباع نشده است كه در محل پیوند های دوگانه چربيها و اسيدهاي چرب انجام مي گيرد
  • ج) تشخيص چربيهاي اشباع شده از چربيهاي اشباع نشده

چند قطره اسيد اولئيك يا روغن زيتون را در لوله آزمايش مي ريزيم.

 و يك تا دو قطره محلول اسيد اسميك 2% بدان مي افزاييم، رنگ سياهي ايجاد مي شود.

اين آزمايش با اسيد پالميتيك خالص منفي خواهد بود.

 اسيد اسميك محل پیوندهای دو گانه را اکسید می کند .

استرهاي اسيد اسميك كه سياه رنگ مي باشند تشكيل مي شود:

  • 4 شناسايي گليسرول درتركيب يك گليسريد

در لوله آزمايش كاملاً خشكي يك تا دو قطره روغن زيتون مي ريزيم.

 و سپس قدري پودر سولفات پتاسيم بدان مي افزاييم.

 و مخلوط را روي شعله حرارت مي دهيم .

ابتدا بي سولفات پتاسيم  در 200 درجه حرارت ذوب مي شود.

و سپس در اثر حرارت روغن زيتون تجزيه مي شود و گليسرول آن آزاد مي گردد.و در اثر بي سولفات پتاسيم كه به شدت آبگير است، گليسرول تبديل به آلدئيدي بنام اكرولئين مي شود.

بخارات سفيد اكرولئين كه از لوله متصاعد مي شود داراي بوي مشخصي است و باعث تحريك دستگاه تنفسي مي گردد.

  • 5 روشهاي مختلف تشخيص گليسرول

گليسرول را به چند طريق مي توان مشخص كرد:

الف) تبديل گليسرول به اكرولئين و تشخيص اكرولئين به وسيله بوي مخصوص آن و يا به وسيله معرف شيف (Schiff).

ب) تبديل گليسرول به آلدئيد گليسريك و دي هيدروكسي استن
               

  • ب) تبديل گليسرول به آلدئيد گليسريك و دي هيدروكسي استن
  • اگر 1 ميلي ليتر گليسرول را با 20 قطره آب برم مخلوط كنيم .
  • و براي مدت 20 دقيقه در آب جوش بگذاريم رنگ محلول كاملاً از بين مي رود.
  • در صورتيكه رنگ به كلي از بين نرود، باز محلول را مي جوشانيم تا بيرنگ شود.
  • در اين عمل مخلوطي از آلدئيدگليسريك و دي اكسي استن در اثر اكسيداسيون گليسرول به وسيله آب برم به وجود مي آيد.
  • كلسترول
  •             كلسترول در اكثر نسوج حيواني يافت مي شود.
  •        و به مقدار زياد در نسج عصبي و صفرا وجود دارد.
  •        تحقيق روي بيوسنتزو متابوليسم اين استرول اخيراً خيلي مورد توجه قرار             گرفته است.
  •       زيرا در آترواسكلروز (Atherosclersis) مقدار اين تركيب خيلي زياد مي        شود.
  • [
  • 1]
  • شنا سایی کلسترول
  • الف) آزمايش سالكوفسكي (Salkowski)
  • چند ميلي گرم از ماده را در لوله آزمايش ریخته ودر 3 میلی لیتر کلروفرم حل کنید.
  •  3میلی لیتراسيد سولفوريك خالص ‌اضافه كرده  و به آرامي تكان دهید.
  • بگذارید دو لايه محلول جدا شود رنگ ظاهر شده را يادداشت كنيد.
  • لايه كلروفرمي كدام يكي است؟
  • رنگ لايه اسيد سولفوريكي را بنويسيد.
  • ب) آزمايش ليبرمن بورشارد (Liebermann-Burchard)
  • يك نمونه محلول كلروفرمي كلسترول مانند آزمايش قبل تهيه کنید.
  • و به آن 10 قطره انيدريد استيك و 2 قطره اسيد سولفوريك غليظ اضافه كرده به آرامي تكان دهید وبگذارید 5 دقيقه بماند.
  • رنگ حاصله داخل لوله را يادداشت كنيد.
  • اين دو آزمايش را از نظر حساسيت با يكديگر مقايسه كنيد.
  • ج) رسوب کلسترول باديژيتونين
  • دو ميلي گرم كلسترول را در 2 ميلي ليتر الكل حل کنید.
  •  اين محلول را به 2 ميلي ليتر محلول الكلي 1% ديژيتونين اضافه کنید.
  • رسوب تشكيل شده كلسترول آزاد است.
  • 7 انديس صابوني كردن (Saponification)

تعريف – عدد صابوني ؛مقدار ميلي گرم پتاسي است كه براي صابوني كردن كردن يك گرم چربي لازم است.

عدد صابوني اطلاعات مفيدي از چگونگي اسيدهاي چربي كه با گليسرول تركيب شده اند  بما مي دهد.

  • کار برد عدد صابونی
  • مقدار پتاسي كه براي صابوني كردن اسيدهاي چرب مختلف لازم است با وزن ملكولي آنها نسبت معكوس دارد.
  •  براي هر نوع چربي طبيعي عدد صابوني شناخته شده است.
  • با اندازه گيري عدد صابونی مي توان به درجه خلوص چربي ها پي برد.
  •  در كنترل و بازرسي  مواد غذايي و شناخت تقلب چربي‌ها، اندازه گيري انديس صابون متداول مي باشد.
  • 8 انديس يد (Iodine Number)
  • تعريف – انديس يد چربي ها عبارت از مقدار گرم يدي است كه صد گرم چربي مي تواند جذب كند.
  •  يد جذب شده پيوندهاي دو گانه اسيدهاي چرب غيراشباع را، اشباع مي كند .
  • چربي هايي مايع و غني از اسيدهاي چرب غير اشباع نسبت به چربي هاي جامد يا نيمه جامد، انديس يد بزرگتري خواهند داشت.
  • صابونی کردن چیست؟
  • صابوني كردن :هيدروليز يك استر به الكل و اسيد و يا نمك مربوطه است.
  • در مورد چربيها صابوني كردن واكنش بين قليايي و چربي است كه ؛
  • منجر به تشكيل صابون و گليسيرين مي شود.
  •  از طرف ديگر اصطلاح صابوني كردن به هر نوع هيدروليز چربي نيز اطلاق مي شود.
  • اندیس صابونی
  • انديس صابوني که بعضي مواقع عدد صابوني نيز ناميده مي شود؛
  •  عبارتست از مقدار ميلي گرم هيدروكسيد پتاسيمی كه براي صابوني كردن يك گرم روغن لازم  است.
  •  انديس صابوني مربوط به ميانگين وزن مولكولي روغن است.
  • معادل صابوني[1] عبارتست از مقدار گرم روغني كه به وسيله يك مولكول گرم (108/56 گرم) هيدروكسيد پتاسيم صابوني مي شود.
  • انديس خنثي و معادل خنثي[2]- به ترتيب همان تعاريف فوق مي باشد كه به جاي گليسيريدها اختصاصاً براي اسيدهاي چرب بكار مي روند.

  • [1] - Saponification equivalent.
  • [2] - Neutralization Vilue, Neutralization equivalent.
  • اندازه گيري انديس صابوني

اساس روش:

 حرارت دادن هيدروكسيد پتاسيم با مقدار معلوم روغن تا تكميل صابوني شدن؛

  و تيتراسيون قلياي اضافی  به وسيله اسيد استاندارد است.

   انديس صابوني از مقدار قليائي كه با نمونه واكنش مي دهد محاسبه مي شود.

C3H5(COOR)3 + 3KOH→ 3RCOOK + C3H5(OH)3     

  • مواد و محلولهاي لازم
  •           محلول تقريباً يك دوم نرمال پتاس الكلي
  •          محلول اسيد كلريدريك يك دوم نرمال دقيقاً استاندارد شده
  •           شناساگر فنل فتالئين

          وسایل لازم:

•                 بالن 250 میلی لیتری

•                 بن ماری جوش

•                مبرد تر جیحا حلزونی

  • روش كار
  • اگر روغن مايع نباشد آنرا ذوب كرده و با كاغذ صافي صاف كنيد .
  •  حدود 2 گرم روغن  صاف شده دقيقاً وزن كرده وآنرا به بالن 250 ميلي ليتري منتقل نمائيد.
  • با يك پيپت دقيقاً 25 ميليمتر محلول پتاس الكلي نيم نرمال به بالن اضافه كنيد  .
  • بالن را به مدت یک ساعت در حالت رفلو قرار دهید.
  • همزمان یک شاهد را اجرا کنید.
  • پس از یک ساعت  با محلول اسید نیم نرمال تیتر( فنل فتالئین ) کنید.

  

. انديس صابوني را از رابطه زير بدست آوريد:

28.05(A-B)              

W                    

A = مقدار ميلي ليتر اسيد كلريدريك 5/0 نرمال بكار رفته براي تيتراسيون شاهد.

B= مقدار ميلي ليتر اسيد كلريدريك 5/0 نرمال بكار رفته براي تيتراسيون نمونه.

W = وزن روغن بر حسب گرم.

  • انديس پراكسيد

اندازه گيري انديس پراكسيد بهترين وسيله موجود براي ارزيابي اكسيداسيون روغن مي باشد.

 زيرا وقتي كه در روغن پراكسيدها يافت شوند مسلماً در آن اكسيداسيون بوجود آمده است.

 اما سؤالي كه جواب دقيق به آن مشكل است اينستكه روغن تا  چه حد اكسيد شده است.

انديس پراكسيد را معمولاً با روش يدومتري تعيين ميكنند .

        دو منبع اصلي خطا با روش يدومتري عبارتند از:

        الف – جذب يد در باندهاي اشباع نشده مواد چرب

        ب – آزاد شدن يد از يدور پتاسيم به علت اكسيژن موجود در محلول           تيترشونده.

  • الف خطاي ناشي از اكسيژن

اكسيژن محلول  در نمونه، حلال و ساير مواد واكنش كننده باعث آزاد شدن يد    ازيدور پتاسيم مي شود                    

4I+ O2            2I2+2H2O                              

اين واكنش كه به نام واكنش خطاي اكسيژن ناميده شده است، باعث مي شود كه انديس پراكسيد بيش از حد واقعي بدست آيد.

      (روش سرد)

      نمونه شماره 1    141     -      113    116   116

      (روش سرد)

      نمونه شماره 2   150    123   121    121    -

      (روش داغ)

      نموه شماره 1    135     -      115    113    112

      (روش داغ)

      نمونه شماره 2  139   116   110   112    112

حلال مناسب برای اندازه گیری پر اکسید

بهترين حلال مخلوطي از اسيد استيك و كلروفرم به نسبت حجمي (2+ 3) است

  

در حال حاضر نيز از اين مخلوط استفاده مي‌شود.

  

در صورتي كه نسبت اسيد استيك به كلروفرم تغيير كند نتيجه آزمايش ممكن است تغييرنمايد.

  • ج شرايط واكنش

زمان واكنش در روشهاي مختلف از يكدقيقه تا يك ساعت است.

درجه حرارت آزمايشگاه تا نقطه جوش محلول پيشنهاد شده است.

در مورد نمونه هائيكه انديس پراكسيد بالائي دارند، واكنش يكساعته نتايج بهتري مي دهد.

  • محلولهای لازم در اندازه گيري انديس پراكسيد

مخلوط اسيد استيك و كلروفرم2)  : 3  .(

محلول يدور پتاسيم اشباع شده تازه.

محلول تيوسولفات سدم 1/0 نرمال

محلول شناساگر نشاسته ،محلول 1 درصد.

  • روش اندازه گیری اندیس پرکسید
  • 5گرم نمونه در ارلن وزن کنید.
  • 30 میلی لیتر مخلوط اسید استیک وکلروفرم.
  • 5/0میلی لیتر محلول یدید پتاسیم.
  • 30میلی لیتر آب مقطر.
  • با تیو سولفات 1/0 تیتر کنید ، پس از زایل شدن رنگ زرد ،نشاسته اضافه کنید
  • تا از بین رفتن رنگ آبی ادامه دهید.
  • محاسبه

انديس پراكسيد بر حسب ميلي اكي والان پراكسيد در 1000 گرم نمونه برابر است با:

S×N×1000                             

W                                     

S      =  ميلي ليتر تيوسولفات مصرفي

     = Nنرماليته محلول تيوسولفات سديم

W     = وزن نمونه بر حسب گرم

  • اسيدهاي آمينه و پروتئين ها

پروتئين ها پلي مرهاي اسيدهاي آمينه می باشند.

وزن ملكولي پروتئن ها زياد مي باشد.

 بيست اسيد آمينه مختلف در پروتئينهاي حيواني و گياهي شركت مي كنند.

  • واكنشهاي اختصاصي اسيدهاي آمينه

1 حلاليت

حلاليت اسيدهاي آمينه در آب متفاوت است.

در حدود 50 ميلي گرم از اسيدهاي آمينه گليسين، تيروزين را در دو لوله جداگانه مي ريزيم .

 به هر يك 10 ملي ليتر آب مقطر افزوده و خوب تكان مي دهيم

حلاليت اين دو را در آب مشاهده ونتیجه را گزارش می کنیم.

  • 2 واكنش گزانتو پروتئيك (Xanthoproteic)
  • يك ميلي ليتر از اسيد آمينه گليسين و يك ميلي ليتر تيروزين (كه قبلاً تهيه كرده‌ايم) در دو لوله جداگانه مي ريزيم.
  •  يك ميلي ليتر اسيد نيتريك غليظ افزوده و مي جوشانيم .
  • رنگ محلول تيروزين زرد مي شود چنانچه كمي سود غليظ به آن اضافه كنيم محلول نارنجي مي گردد.
  • ايجاد رنگ زرد مربوط به حلقه بنزني است.
  • 3 واكنش ميلون (Millon)
  • 2 تا 3 ميلي ليتر از محلول گليسين و تيروزين را جداگانه در دو لوله آزمايش مي ريزيم. و چند قطره از معرف ميلون (نيترات و نيتريت جيوه در اسيد نيتريك) به هر يك اضافه مي كنيم .
  •  محلول را مي جوشانيم لوله محتوي تيروزين قرمز رنگ مي شود.
  • پيدايش اين رنگ مربوط به وجود بنيان حلقه فنلي تيروزين است.
  • 5 واكنش نين هيدرين (Ninhydrine)
  • كليه اسيدهاي آمينه كه داراي آلفا آمينوي آزاد هستند (به استثناي پرولين و هيدروكسي پرولين) بانين هيدرين (هيدرات تري ستوهيدرندن)واکنش می دهند.
  • انيدريد كربنيك و آمونياك آزاد می شود.
  • يك تركيب آبي رنگ  ایجاد می شود.
  • روش آزمایش با نین هیدرین
  • 3 ميلي ليتر از محلول يكي از اسيدهاي آمينه را در لوله آزمايش بریزید.
  • چند قطره از محلول 0.1 درصد نين هيدرين در استن به آن اضافه کنید.
  •  لوله را به مدت 10 دقيقه در حمام آب جوش قرار دهید.
  • ر نگ آبي حاصل را مشاهد کنید.
  • 6 آزمايش اسيدهاي آمينه گوگرد دار (Sulfur Test)
  • در يك لوله آزمايش مقدار كمي سيستين ودرلوله دیگرمتيونين بریزید.
  • بهر كدام 5  ميلي ليتر سود 10%‌ اضافه کنید.
  • .لوله ها را 15 دقيقه در حمام آب جوش قراردهید.
  • 10 قطره استات سرب 5% بهر يك اضافه ي كنيد.
  •  رنگ محلول تيره شده به سياهي مي گرايد.
  • به آرامي 2 ميلي ليتر اسيد كلريدريك غليظ اضافه کنید.
  •  بوي نامطبوعي استشمام ميشود(؟)
  • 7 آزمايش ساكا گوچي (Sakaguchi)
  • يك ميلي ليتر محلول آرژي نين را در لوله آزمايش تهيه مي كنيم .
  • مقدار جزئي محلول الكلي آلفانفتل و 2 تا 3 قطره محلول هيپوبرميت سديم و مقدار كمي هيدروكسيد سديم بدان مي افزائيم.
  •  رنگ قرمزي ايجاد مي شود.
  • اين واكنش مربوط به ريشه گوانيدين مي باشد و براي يك در ميليون محلول آرژي نين مثبت است.
  • اين آزمايش را با محلول اسيدهاي آمينه تيروزين يا تريپتوفان نيز انجام دهيد.
  • تشخيص و تعيين مقدار يك اسيد آمينه به وسيله فرمل تيتراسيون

ابتدا به وسيله فرمالدئيد عامل آميني را مهار كرده.

 سپس جسم حاصل را مثل اسيد آلي مي سنجيم .

اين آزمايش به نام روش سورنسن   Soraensen يا فرمل تيتراسيون ناميده مي شود.

      NH2                                  HN-CH2OH           HOCH2-N-CH2OH  

 H2C=O                             H2C=O                              

R-C-COO-                                  R-C-COO-            R-C-COO           

   H                                       H                             H                 

  • تعيين مقدار يك اسيد آمينه
  • در يك ارلن كوچك 10 ميلي ليتر از اسيد آمينه می ریزیم.
  • 10 ميلي ليتر فرمل باPH حدود 9 1اضافه می کنیم.
  •  با سود 1/0  نر مال تیترمي كنيم تا رنگ صورتي كم رنگ مجدداً ظاهر گردد
  • از مقدار سود مصرفي غلظت اسيد آمينه را محاسبه ميکنیم.

 

1به روي 20 ميلي ليتر فرمل در مقابل فنل فتالئين قطره قطره سود دسي نرمال مي افزائيم تا رنگ صورتي كمرنگ ايجاد شو.د PH= 9.

محا سبه مقدار میلی گرم اسید آمینه

                

    

               n=میلی لیتر سود مصرف شده       

                   M= وزن مولکولی اسید آمینه    

  • نقطه ايزو الكتريك اسيدهاي آمينه و پروتئينها

مقدمه

پروتئينها، اسيدهاي  آمينه، فسفوليپيدها و ...

در ساختمان مولكولي خودعامل اسيدي و قليايي توائم دارند

.اين تركيبات داراي خاصيت آمفوتري هستند .

يعني هم خاصیت اسيدی دارند وهم خاصیت بازی.

  • تعريف PH ايزو الكتريك

يونيزاسيون اسيدهاي آمينه و پروتئينها در PH معيني به حداقل مي رسد.

، در نتيجه يونهاي مثبت و منفي آن برابر مي شوند،

اين PH را نقطه ايزوالكتريك ميگويند.

اغلب پروتئين ها در PH ايزوالكتريك به مقدار ناچيزي در آب حل مي شوند،

 نقطه ايزوالكتريك چند اسيد آمينه و پروتئين به قرار زير است:

  • اندازه گيري PH ايزو الكتريك كازئين

  روش کار :

  • در يك بالن ژوژه 100 ميلي ليتري 0.5 گرم كازئين خالص و 40 ميلي ليتر آب  و 10ميلي ليتر سود نرمال مي ریزیم.
  • پس از حل شدن كامل كازئين 10 ميلي ليتر اسيد استيك نرمال افزوده .
  •  حجم را تا 100 ميلي ليتر با آب مقطر كامل مي كنيم .
  • خوب مخلوط مي نمائيم.
  • در9 لوله آزمایش، طبق جدول بعد، محلولهاي لازم را در هر يك مي ريزيم.
  • به هر يك از لوله ها يك ميلي ليتر از محلول كازئين افزوده؛
  • لوله ها را بلافاصله تكان مي دهيم ،
  •  كدورت حاصله را بعد از 10 و 30 دقيقه ملاحظه مي كنيم،
  •  نتيجه را بر حسب شدت كدورت از صفر تا چهار (+) مشخص مي نمائيم.

در كدام يك از لوله ها رسوب بيشتر ايجاد شده است ؟

PH نقطه ايزوالكتريك كازئين چقدر است؟

  • كلسترول
  • كلسترول از گروه الكل هاي جامد حلقوي به نام استرول مي باشد .
  • كه به
  •  با اسيدهاي چرب ايجاد استريدها (يك نوع ليپيد) مي نمايد،
  • كلسترول به طور طبيعي در خون و سلولهاي تمام بافتهاي حيواني به مقادير مختلف يافت مي شود.
  • علاوه بر كلسترول كه توسط مواد غذايي به بدن مي‌رسد
  • تقريباً در تمام سلولهاي بدن و به ويژه در كبد كلسترول از طريق متراكم شدن ريشه هاي دو كربن دار استات توليد مي شود،.
  •  كلسترول در كبد به اسيدهاي صفراوي، در غدد فوق كليوي و غدد مترشحه هورمونهاي جنسي به هورمونهاي استروئيدي و بالاخره در زير پوست (مشتق دهيدروكلسترول) به ويتامينD تبديل مي گردد.
  •       اصول روش اندازه گیری کلسترول در سرم
  •  كلسترول را به كمك حلالهاي آلي از سرم و پروتئينها جدا نموده.
  •   بر روي محلول آن يك واكنش رنگي انجام مي دهيم.
  • شدت رنگ حاصل را با يك محلول استاندارد كلسترول مي سنجيم.
  • معرف ها:
  •  محلول استاندارد كلسترول 100 ميلي گرم درصد ميلي ليتر كلروفرم
  • محلول اتر و الكل (يك حجم اتر و سه حجم الكل)
  •  انيدريد استيك خالص
  •  اسيد سولفوريك خالص
  •  كلروفرم
  • روش کار

1 – ده ميلي ليتر مخلوط اتر و الكل را در يك لوله سانتريفوژ ريخته 0.2 ميلي ليتر سرم به آن اضافه مي نمائيم.

2 – دهانه لوله را بسته و يك الي دو دقيقه به شدت تكان مي دهيم و ده دقيقه به حال خود مي گذاريم.

3 –پنج دقيقه سانتريفوژ مي نمائيم.

4- محلول را با دقت در داخل يك بشر كوچك T)  ) می ریزیم.

5  – بشر را بر روي بن ماري جوش قرار مي دهيم تا محلول تبخير شود.

ادامه روش کار

6 – 0.5 ميلي ليتر محلول استاندارد كلسترول در بشر كوچك ديگري( S )مي ريزيم.

7 – دقيقاً 6 ميلي ليتر كلروفرم به بشر T و 5.5 ميلي ليتر به بشر S اضافه كرده كاملاً مخلوط مي نمائيم.

8 – به هر يك از دو بشر دو ميلي ليتر انيدريد استيك اضافه و مخلوط مي نمائيم.

9 – به هر يك از دو بشر 0.1 ميلي ليتر اسيد سولفوريك خالص مي افزائيم و كاملاً مخلوط مي نمائيم و.

 بشرها را براي مدت 5 دقيقه در حرارت 25 درجه (حرارت آزمايشگاه) و در محل تاريكي قرار مي دهيم تا رنگ کامل شود .

  • اندازه گيري دانسيته اپتيك ومحاسبه

1 –طول موج 660 ميلي مو را نتخاب می کنیم.

2 –با يك لوله حاوي كلروفرم (بلانك)  جذب را صفر  مي‌ کنیم.

3 – دانسيته اپتيك محلولهاي بشر T و S را به ترتيب مي خوانیم.

4-درصد کلسترول را محاسبه می کنیم

  •     آنزيم ها

آنزيم ها يا كاتاليزورهاي حياتي ساختماني پروتئيني دارند.

 بعضي آنزيمها از پروتئين هاي ساده تشكيل شده اند (مانند پپسين) .

ولي اكثر آنزيمها از پروتئين هاي تركيبي به وجود آمده اند؛

ساختمان آنها از دو قسمت تشكيل شده است:

 يكي قسمت پروتئيني به نام آپوآنزيم ،

و یک قسمت غيرپروتئيني بنام ريشه پروستتيك كه به آن كوآنزيم گفته مي شود.

  • واكنش هاي عمومي آنزيم

عوامل  موثربر سرعت واكنش آنزيم ها  :

1 –   درجه حرارت   

2 – همبستگي فعاليتهاي آنزيمی  با غلظت سوبسترا و غلظت آنزيم.

3 –   PH روي فعاليت آنزيمها

4 – اختصاصي بودن عمل آنزيمها

5 – اثر مهار كننده ها و مواد ضد عفوني كننده.

1 بررسی اثر درجه حرارت روي فعالیت آنزيمها

در هر يك از 4 لوله آزمايش 5 ميلي ليتر شير (سري A).

  در هر يك از 4 لوله ديگر (سري (B يك ميلي ليتر محلول 0.5 درصد Rennin مي ريزيم.

از هر سري يك لوله انتخاب مي كنيم.

دو لوله محتوي شير و رنين را به ترتيب لوله هاي اول را در بشر آب و يخ  

لوله هاي دوم را در حرارت آزمايشگاه

لوله هاي سوم را در آب 37 تا 40 درجه

و لوله هاي چهارم را در آب 80 درجه قرار مي دهيم.

ادامه بررسی اثر دما روی فعالیت  انزیم

بعد از چند دقيقه محلول رنين  را به لوله هاي محتوي شير نظير خود مي افزائيم .

فوراً مخلوط كرده و زمان را يادداشت مي كنيم.

 لخته شدن شير را در لوله ها به دقت تحت نظر قرار مي دهيم.

بعد از يك دقيقه، 5 دقيقه ، 10 دقيقه و 30 دقيقه تغييرات حاصله در لوله ها را بررسي ميكنيم.

 در كدام يك از لوله ها انعاقد انجام نگرفته است. بهترين درجه حرارت براي فعالیت رنين  رامشخص می کنیم.

  • 2 فعاليت آنزيم

الف ) اثر غلظت آنزيم

  • در سه لوله آزمايش به ترتيب 1 ميلي ليتر 0.5 ميلي ليتر، 0.25 ميلي ليتر رنين 0.2 درصد مي ريزيم.
  •  سپس به لوله دومي 0.5 و به سومي 0.75 ميلي ليتر آب اضافه مي كنيم.
  •  در سه لوله ديگر و در هر يك 5 ميلي ليتر شير مي ريزيم.
  • لوله هاي محتوي آنزيم و شير را در حمام 37 تا 40 درجه قرار مي دهيم.
  •  پس از چند لحظه هر يك از لوله هاي شير را به محتوي هر لوله آنزيم اضافه مي كنيم.
  •  لوله ها را مخلوط كرده و زمان را يادداشت مي كنيم.
  •   زمانی را که طول مي كشد تا هر يك از لوله ها منعقد گرددتعیین کنید..
  • ب) اثر غلظت سوبسترا
  • در سه لوله آزمايش به ترتيب 10 و 8 و 6 ميلي ليتر شير ميريزيم.
  •   هر يك را با آب به 10 ميلي ليتر مي رسانيم.
  •  لوله ها را در حمام 37 تا 40 درجه قرار مي دهيم.
  •   به هر لوله 2 ميلي ليتر رنين 2/0 اضافه مي كنيم.
  •  زماني كه جهت انعقاد هر لوله لازم است يادداشت مي كنيم.
  • از اين دو آزمايش (الف – ب) چه نتيجه اي مي گيريم؟
  • 3 اثر PH روي فعاليت آنزيمها

با جويدن پارافين جامد مقداري از بزاق خود را جمع آوري کنید.

 سپس آنرا با كلرور سديم 1% تا 5 بار رقيق  کنید.

در چهار لوله آزمايش به ترتيب:

 در اولي 2 ميلي ليتر اسيد كلريدريك 0.4 درصد((PH=1،

 در دومي 2 ميلي ليتر اسيد لاكتيك 0.1 درصد(PH=5)،

 در سومي 2 ميلي ليتر آب مقطر(PH=7)

و در چهارمي 2 ميلي ليتر كربنات سديم 1% (PH=9) بریزید.

ادامه آزمایش اثر PH روی فعالیت آنزیم

  • به هر لوله 2 ميلي ليتر نشاسته 1% (پخته) ؛
  •   2 ميلي ليتر بزاق رقيق شده اضافه کنید  .
  •  لوله ها را خوب مخلوط كرده و در حمام 37 تا 40 درجه قراردهيد.
  • پس از 15 دقيقه لوله ها را از حمام بيرون آورده ؛
  •  در مورد هر يك آزمايش يد را انجام دهید.
  • ادامه آزمایش اثر PH
  • در روي يك كاشي سفيد(يا 4 لوله آزمايش) 4 قطره يد به طور جداگانه قرار دهید.
  •  .ازهر لوله يك قطره نشاسته به قطره يد مربوطه اضافه کنید.
  •  ايجاد رنگ آبي دليل بر وجود نشاسته هضم نشده است.
  • در كدام لوله هضم نشاسته بهتر صورت گرفته است ؟
  •  بهترين  را  PHمشخص كنيد.
  • 4 اختصاصي بودن عمل آنزيمها

هر آنزيمي روي سوبستراي مشخصي عمل مي نمايد.

  اوره آز روي اوره اثر كرده و آمونياك آزاد مي كند .

در حاليكه روي تيواوره كه از نظر فرمول كاملاً شبيه اوره مي باشد اثري ندارد

اوره 2 (2   CO(NH        تیواوره  CS(NH2)2

                                                  

آزمایش اختصاصی بودن آنزیمها

در  دو لوله آزمايش در اولي 5 ميلي ليتر اوره 1% و در ديگري 5 ميلي ليتر تيو اوره 1% مي ريزيم.

 به هر دو لوله چند قطره فنل رد و سپس 1 ميلي ليتر اوره آز فعال اضافه مي كنيم

 لوله ها را در حمام آب 37 تا 40 درجه قرار مي دهيم.

پس از 15 دقيقه تغيير رنگ را در دو لوله مشاهده مي كنيم.

فنل رد در محيط اسيدي زرد رنگ و در محيط قليايي قرمز رنگ است.

از اين آزمايش چه نتيجه اي مي گيريم؟

  • 5 اثر مهار  كننده ها و ضد عفوني كننده ها
  •  در چهار لوله و در هر يك 5 ميلي ليتر شير مي ريزيم .
  •  سپس 7 تا 8 قطره ؛
  •  تولوئن به لوله اول   كلروفرم به لوله دوم ، فنل 5% به لوله سوم و
  •  آب مقطر به لوله چهارم اضافه مي كنيم .
  • لوله ها را در حمام آب 37 تا 40 درجه قرار مي دهيم .
  • سپس به هر يك از چهار لوله يك ميلي ليتر رنين 0.2 درصد اضافه مي كنیم.
  •  پس از 5 دقيقه انعقادرا در لوله ها نسبت به لوله كنترل مورد توجه قرار مي دهيم.
  • انعقاد در كدام يك از لوله ها صورت نمي گيرد؟ چرا؟
  • منابع فارسی

1-شاملو،یوسف.کامیاب،ثریا.آموزش آزمایشگاهی بیوشیمی عمومی،مرکز نشر دانشگاهی تهران ،1361.

2-هاشمی تنکابنی،سید ابراهیم.آزمایش روغنها وچربیها،مرکز نشر دانشگاهی ،چاپ اول ،1364 .

3-مورای ،روبرت.ک،گرانر.داریل ،ک.ترجمه ملک نیا، ناصر.شهبازی ،پرویز.بیوشیمی هارپر.جلد اول. جلد دوم. نشر شهر آب،1380 .

4- دانیال زاده،آلبرت.اصول بیوشیمی.جلد اول.نشر دانشگاهی. چاپ چهارم.1372 .

5- رضا،رضایی. روش های نوین آزمایشگاهی ،جلد اول.انتشارات دفتر مرکزی جهاد دانشگاهی.1364 .

  • منابع انگلیسی

6- Lehninger,Albert.Principles of Biochemistry Worth publisher,Inc.First Edition . 1982

7-Bishop,Nichael L.Duben-von Laufen Janet L. Clinical Chemistry.J.B.Lippincott Company ,1985.

8-Tietz Norbert W.Fundamentals of clinic Chemistry.