تشخیص ژنوم ویروس

به نام هستی بخش وجود

Virology course

Masoud Youssefi, MD, PhD

تشخیص ژنوم ویروس

---

براي اين كار از شيوه هاي مختلف استفاده مي شود كه همگي بر پايه دتکت کردن DNA یا RNA ویروس  در نمونه است که دو روش دارد  ׃ روشهای هیبریدیزیشن و روش PCR

Hybridization techniques

در این روشها یک پروب که  قطعه ای DNA تک رشته ای  است طوری طراحی می شود که سکوئنس  یا توالی مکمل قسمتی از ژنوم ویروس را داشته باشد.

پروب با ماده رادیو اکتیو نشاندار می شود.

پروب تحت شرایط ویژه در آزمایشگاه به قطعه مکمل خود درژنوم ویروس متصل می شود.

پروب های باند نشده شسته و پروب باند شده دتکت می شود.

Southern blotting

¨      توسط محققی انگلیسی به نام Edwin Southern معرفی شد.

¨      فرگمنت های DNA بر روی ژل آگاروز الکتروفورز میشوند.

¨      فرگمنت های جدا شده به وسیله الکتریسیته یا با خاصیت موئینگیcapillary action  از ژل به مامبران نیتروسلولز یا نایلون منتقل میشوند.

¨      فرگمنت های DNA منتقل شده بر مامبران با محلول قلیایی دناتوره و با baking کباب کردن یا UV irradiation بر سطح مامبران فیکس می شوند.

¨      پروب نشانداربا ماده فلورسنت یا رادیواکتیو به همراه محلول هیبریدیزیشن اضافه شده و پروب های باند نشده، شسته می شوند.

¨      سیگنال با فیلم x-ray قابل رویت می شود

 

Northern blotting

¨      واریانتی از southern blotting می باشد.

¨      در این تکنیک RNA دتکت می گردد.

¨      مراحل مشابه تکنیک قبلی است:

¨      RNA از نمونه استخراج می شود، سپس بر روی ژل الکتروفورز شده و به مامبران ترانسفر می گردد. RNA ترانسفر شده با پروب اختصاصی نشاندار باند شده و سیگنال مربوطه با اتورادیوگرافی دتکت می شود.

¨      پروب می تواند با ماده رادیواکتیو (³²P)، یا با آنزیم HRP ویا AP نشاندارشود. گاه پروب با یک لیگاند (Biotin) مزدوج میشود، بیوتین با affinity بالا به avidin وStreptavidin  نشاندار شده با آنزیم، باند می شود.

 

Insitu hybridization

مشابه IHC ولی در اینجا به جای پروتئین، DNA ویا RNA پاتوژن در نمونه بافتی دتکت می شود.

¨      نمونه فیکس شده و در شرایط ویژه پروب اختصاصی نشاندار با سکوئنس مکمل در نمونه باند می شود. پروب های باند نشده شسته می شوند و سیگنال مربوط به پروب باند شده دتکت می شود.

¨      پروب میتواند با ماده رادیواکتیو، ماده فلورسنت، و یا آنتی ژنی به نام Digoxigenin نشاندار شود. این آنتی ژن با آنتی بادی کونژوکه به آنزیم دتکت خواهد شد.

¨      سیگنال با اتورادیوگرافی، میکروسکوپ فلورسنت، یا میکروسکوپ نوری ساده دتکت می شود.

PCR

ازدیاد مقادیر کم DNA در محیط آزمایشگاه  تا حدی که بر روی ژل قابل رویت شود.

نیاز به DNA الگو- -primers DNA polymerase مقاوم به حرارت ودزوکسی نوکلئوزید تری فسفات dNTP و شرایط بافری مناسب و یون  منیزیوم دارد.

پرایمرها تک رشته ای بوده و سکوئنس یا توالی اختصاصی DNAمی باشند.

DNA polymerase با مصرف dNTP ها رشته مکمل را به دنبال پرایمر می سازد.

مراحل PCR

دو رشته DNA با حرارت حدود95 درجه باز می شود melting=denaturing

دما تا 50 درجه کاهش داده می شود تا پرایمر به قسمت مکمل خود در DNA بچسبد.  anealing

Taq DNA polymerase دردمای حدود 72 درجه سبب ساختن DNA جدید می شود.extension

برای سیکل بعد هم DNA الگو و هم DNA ساخته شده به عنوان الگو عمل می کنند یعنی تعداد رشته های هدف DNA در هر سیکل دو برابر می شود.

سیکل 30-20 بار تکرار و مقادیر زیادی DNA ساخته می شود

ماشین قابل تنظیم اتوماتیکی که سیکل های دمایی را انجام می دهد ترمو سایکلر نامیده می شود.termocycler

RT-PCR

در مورد ویروس های RNA دار، ابتدا RNAویروس از نمونه آزمایشگاهی استخراج می شود وسپس به کمک آنزیم ترانس کریپتاز معکوس Reverse transcriptase- RT به DNA تبدیل میگردد.

DNA حاصله سپس با روش PCR تکثیر میشود. به این روش RT-PCR می گویند.